Свято-Троицкое братство ещё в 1588 году получило от Константинопольского Патриарха Иеремии II права ставропигии — независимость от местной церковной власти и особые привилегии. Эти права перешли к Свято-Духову монастырю; монастырский общежительный устав был принят в 1614 году. Первым настоятелем стал архимандрит Леонтий (Карпович).

При митрополите Виленском и Литовском Хризостоме в 1990-е годы храм был основательно обновлён. В 1997 году саркофаг с мощами из крипты был перенесён напротив иконостаса.